动脉粥样硬化的新调控基因-JAZF1和KLF14

【摘要】第一部分JAZF1影响胆固醇代谢的分子机制研究目的：探讨JAZF1过表达对小鼠体内外胆固醇代谢的影响及其可能的分子机制。方法：用RT-qPCR检测肝组织中JAZF1、HMGCR、LDLR、PPARa、SREBP2、INSIG2和SCAP等胆固醇代谢相关基因mRNA的表达；用WesternBlot检测JAZF1、HMGCR和p-CREB的蛋白表达；采用原代细胞培养及腺病毒转染构建JAZF1过表达细胞模型；双荧光素酶报告系统分析JAZF1调节HMGCR转录活性及结合位点；化学比色法检测细胞内胆固醇及相关脂质指标水平变化。结果：Ad-JAZF1感染使C57BL/6J小鼠肝脏内JAZF1mRNA升高约51%，蛋白表达升高约60%。感染使高脂喂养的ApoEKO小鼠肝脏中JAZF1mRNA水平升高37%、蛋白质水平升高近60%；TAK1蛋白水平下降50%；HMGCR的mRNA水平下降80%左右，蛋白降低约50%。Ad-JAZF1转染使原代培养肝细胞中JAZF1的mRNA水平升高近50倍、蛋白升高3倍左右、TC下降27%，HMGCRmRNA和蛋白水平分别下降51%和47%。pGL3-CRE与Ad-JAZF1同时处理使原代肝细胞中荧光素酶活性下降54%，而pGL3-muCRE与Ad-JAZF1同时处理时与对照组相比荧光素酶活性无差异。JAZF1过表达引起CREB在Ser133位点磷酸化水平下降26%。结论：JAZF1过表达能抑制TAK1、HMGCR的表达、降低血浆胆固醇、肝脏组织和原代肝细胞中总胆固醇水平；抑制CREB在Ser133位点磷酸化水平；经CREB途径抑制HMGCR活性和胆固醇的从头合成作用。第二部分KLF14在动脉粥样硬化中的作用研究目的：通过改变KLF14在体内外的表达，探讨其对脂质代谢及动脉粥样硬化的影响，并研究其发挥作用的分子生物学机制。方法：用基因重组技术构建KLF14过表达质粒（pIRES2-EGFP-KLF14）、干扰质粒（pGenesil-shKLF14）和干扰腺病毒（pAd-shKLF14）；用脂质体转染构建巨噬细胞KLF14过表达和抑制表达模型；Ac-LDL诱导形成小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞；MTT法检测细胞活力；用3H-cholesterol标记巨噬细胞，液体闪烁计数法（LSC）测定细胞胆固醇流出率；RT-qPCR测定KLF14、ABCA1、IL-6、TNFα、MCP-1的mRNA表达水平；WesternBlots测定KLF14、ABCA1、p-TAK1/t-TAK1、p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK的蛋白表达水平；用SB203580、PD098059、SP600125分别抑制p38、ERK1/2、JNK的蛋白磷酸化水平，并检测KLF14表达改变对MAPK信号通路和炎症因子表达的影响。24只雄性ApoE-/-小鼠，鼠龄7周，适应性喂养1周，随机分为高脂喂养+PBS组（HF-A组，n=8）、高脂+pAd-GFP组（GFP-A组，n=8）和高脂+pAd-shKLF14组（shK-A组，n=8），均喂养12周，于高脂喂养第8周末和第10周末分别给予尾静脉注射PBS、pAd-GFP和pAd-shKLF14；油红O染色观察小鼠主动脉窦及大体的粥样斑块形成情况；用酶法测定细胞及血浆中胆固醇浓度。结果：KLF14在高脂喂养的C57BL/6J、普食喂养apoEKO小鼠及高脂喂养apoEKO小鼠体内mRNA和蛋白表达水平均比正常饮食小鼠升高；未添加Ac-LDL处理时，KLF14过表达使RAW264.7细胞内TC水平升高约16%、CE升高25%、CE/TC升高7%，抑制表达降低TC约9%、CE约20%、CE/TC约13%；在添加Ac-LDL处理后，KLF14过表达使RAW264.7细胞内TC水平升高27%、CE升高36%、CE/TC升高7%；抑制表达降低TC约16%、CE约32%、CE/TC约19%。KLF14过表达增加了p38、ERK1/2的蛋白磷酸化水平，而JNK磷酸化水平无显著性差异。KLF14过表达使小鼠巨噬细胞内炎症因子IL-6、TNFα和MCP-1的mRNA表达与对照组分别增加了68%、120%和238%。用化学抑制剂抑制p-p38、p-ERK1/2后，在RAW264.7细胞中过表达KLF14不能使炎症因子表达水平升高，而抑制p-JNK后KLF14过表达的作用不明显；而抑制KLF14表达后上述作用呈现相反趋势。过表达KLF14能显著降低ABCA1的mRNA和蛋白表达水平分别达69%和65%，降低细胞胆固醇流出率达63%。在高脂喂养的apoEKO小鼠体内，pAd-shKLF14使肝脏中KLF14表达下降50%、主动脉中中性脂质的含量及主动脉窦中粥样斑块的面积减少，并显著降低血液中TC水平，LDL、TG有下降趋势，而HDL有升高趋势。结论：KLF14在高脂喂养和动脉粥样硬化高风险的小鼠肝脏内有高表达；在小鼠巨噬细胞中过表达KLF14能诱导细胞泡沫化、增加胞内胆固醇和胆固醇酯含量，经p38、ERK1/2途径促进炎症反应和炎症因子IL-6、TNFα和MCP-1的释放；同时降低ABCA1的表达水平，引起胆固醇流出障碍。在小鼠体内抑制KLF14表达有减少动脉粥样硬化斑块、降低血液胆固醇、延缓动脉粥样硬化病变的作用。
【作者】李小强；
【导师】李伶；
【作者基本信息】重庆医科大学，临床检验诊断学，2014，博士
【关键词】JAZF1；TAK1；HMGCR；CREB；胆固醇代谢；KLF14；炎症；MAPK；ABCA1；胆固醇流出；

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